Az élesztőgombák, mint mikroorganizmusok, létfontosságú szerepet játszanak számos biológiai folyamatban és ipari alkalmazásban. Sejtfaluk komplex szerkezete és kémiai összetétele kulcsfontosságú a sejt életképességének és működésének fenntartásában, valamint számos biotechnológiai folyamat alapját képezi. Ez a cikk részletesen tárgyalja az élesztő sejtfalának felépítését, szintézisét és az ehhez kapcsolódó enzimatikus eljárásokat, különös tekintettel az endo-l,3(4)-β-glukanázokra és azok alkalmazásaira.
Az Élesztő Sejtfalának Szerkezete és Kémiai Összetétele
Az élesztőgombák, mint például a Saccharomyces cerevisiae, sejtfala a teljes sejt száraz tömegének körülbelül 20-30%-át teszi ki, ami fontos szerepet játszik a sejtmorfológia fenntartásában és az intercelluláris felismerésben. A gombafélékhez tartozó mikroorganizmusok, mint az élesztőgombák és egyéb gombák sejtfalai komplex szerkezetűek és a β-glukán mellett számos egyéb összetevőt tartalmaznak. Például az élesztőgombák sejtfalai a glukán réteg mellett protein-mannan komplex rétegből állnak (Andrews és Asenjo, 1987).
Az analóg DNS szekvencia olyan endo-β-glukanáz (így például endo-l,3-β-glukanáz és endo-l,3(4)-β-glukanáz aktivitású enzimet kódoló DNS szekvenciát jelöl, amely a fentiekben ismertetett tulajdonságokkal rendelkezik. Az ilyen enzimek kinyerése kívánatos.
Enzim Jellemzés és Aktivitás
Egy elkülönített enzim jellemzése során megállapították, hogy az SDS-PAGE-el meghatározott látszólagos molekulatömege (Mw) körülbelül 31 kDa. Az enzim kinetikai paramétereit és specifikus aktivitását ugyancsak meghatározták. Továbbá azt tapasztalták, hogy a találmány szerinti endo-l,3(4)-β-glukanáz 4.0 és 6.5 közötti pH tartományban több, mint 60%-os aktivitással rendelkezik, az optimális aktivitást jelentő pH érték tartomány pedig 4.5 és 5.5 közötti. Az enzim aktivitást 50 °C-os hőmérsékleten találták optimálisnak. Továbbá a β-glukánok depolimerizációjával és 13C NMR méréssel igazolták, hogy a kinyert enzim l,3(4)-β-endo-l,3(4)-glukanáz aktivitást mutat.
DNS Szekvenciák és Homológia
Az enzim kódolására szolgáló DNS szekvencia például a Trichoderma harzianum, például annak CBS 243.71 számú törzse, cDNS klóntárának átvizsgálásával izolálható, amely törzs nyilvánosan hozzáférhető Hollandiában, Delftben a Centraalbureau voor Schimmelcultures-ban. Ezután kiválaszhatók a megfelelő aktivitású enzimet expresszáló klónok (az endo-l,3(4)-β-glukanáz aktivitású enzim valamely megfelelő szubsztrátum, így például az AZCL-kurdlan és az AZCL-glukán β-l,3(4)-glukán kötéseinek hidrolizáló képességével definiálható). A megfelelő DNS szekvencia ezután a klónból standard eljárásokkal izolálható.
Elvárható, hogy a homológ enzim kódolására szolgáló DNS szekvenciához, azaz valamely analóg DNS szekvenciához, egyéb mikroorganizmusokból is hozzájussunk. Például a DNS szekvencia más mikroorganizmusokból, különösen gombákból, így az Aspergillus sp. törzs, főként az A. aculeatus vagy A. niger törzsek; egy másik Trichoderma sp. törzs, ideértve különösen a T. reesie, a T. viride, a T. longibrachiatum vagy a T. koningii törzseket; vagy a Fusarium sp. törzs, különösen az F. oxysporum törzs; vagy a Humicola sp. törzs; vagy a Rhizopus sp. törzs, főként a Rhizopus arrhizus; vagy az Acremonium sp. törzs; vagy a Botrytis sp. törzs; vagy a Penicillium sp. törzs vagy a Scleotium sp. törzsekből származhat.
Az analóg DNS szekvencia homológia foka a két szekvencia közötti azonosság fokaként kerül meghatározásra, jelezve az első szekvencia másodikból történő származtatását. A homológia megfelelően meghatározható a technika állásából ismert számítógépes programok segítségével. Jellegzetes módon a DNS szekvencia legalább 40 és 50 % közötti, de inkább legalább 60 és 70 % közötti, így legalább 80 %-os vagy 90 %-os azonossági szintet mutat.
Rekombináns Expresszió
A DNS szekvencia ezt követően beilleszthető a rekombináns expressziós vektorba. Ez lehet bármely olyan vektor, amelyen a rekombináns DNS eljárások egyszerűen végrehajthatók, a vektor kiválasztása gyakran attól a gazda sejttől függ, amelybe azt bevisszük. Például, a vektor lehet egy plazmid, amely extrakromoszomálisan létezik, és amelynek replikációja független a kromoszómális replikációtól.
A vektorban az endo-β-glukanáz kódolására szolgáló DNS szekvencia a megfelelő promóter és terminátor szekvenciához működőképesen kell, hogy kapcsolódjék. A promóter bármely DNS szekvencia lehet, amely transzkripcionális aktivitást mutat a kiválasztott gazdasejtben és származhat olyan génekből is, amelyek gazdasejttel homológ vagy heterológ fehérjéket kódolnak. Az endo-β-glukanáz kódolására szolgáló DNS szekvencia, a promóter és a terminátor lekötésére, valamint azoknak a megfelelő vektorokba történő illesztésére használt eljárások szakember számára a technika állásából jól ismert módszerek (vö., például Sambrook és mtsai, Molecular Cloning).
A találmány tárgyát képező enzimet kódoló DNS szekvenciával átalakított gazdasejt előnyösen valamely eukarióta sejt, különösen gomba, mint például élesztőgomba vagy fonalas gomba sejt. A sejt különösen Aspergillus, még előnyösebben az Aspergillus oryzae vagy Aspergillus niger fajok közé tartozik. A gombasejtek átalakíthatók protoplaszt képzéssel és a protoplasztok transzformálásával, melyet a sejtfal önmagában ismert módon végzett regenerációja követ. Gazda mikroorganizmusként Aspergillus alkalmazását írja le az EP 238 023 lajstromszámú európai szabadalmi leírás (Novo/Nordisk A/S).
A gazdasejt lehet valamely élesztőgomba sejt, például valamely Saccharomyces sp. törzs, főként Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri vagy Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces sp. törzs, például Schizosaccharomyces pombe, Hansenula sp. törzs vagy a Pichia sp. törzs vagy Yarrowia sp. törzs, például a Yarrowia lipolytica vagy a Kluyveromyces sp. A transzformált gazdasejteket tartalmazó kultúrához bármely hagyományosan alkalmazott, a kérdéses gazdasejtek szaporodásának biztosításához megfelelő közeg felhasználható.
Élesztő Sejtfal Termékek és Alkalmazásaik
Az élesztősejtfal por megegyezik az élesztő élesztősporával és az élesztőporral. Elsősorban kiváló minőségű sörfőző élesztőjéből készül, modern bio-hajtású technológiát használva, amelyet szennyeződés eltávolításával, autolízissel, elválasztással, koncentrációval, permetezéssel szárítva stb. finomítanak.
Az élesztősejtfal egyfajta mikroorganizmus készítmény, amely gazdag vitaminban, mikroelemekben, különféle enzimekben és tizennyolc típusú aminosavban, és a sejtek mennyisége 85%-ot tesz ki. Az élesztősejtfalakat autolízis, enzim hidrolízis és mechanikai zavarok folyamatával extrahálják, amelyet centrifugálás és szárítás követ. A végtermék egy finom por, világossárga és barna színű.
Főbb Funkciók és Előnyök
Az élesztősejtfal termékek számos funkcionális tulajdonsággal rendelkeznek, amelyek miatt széles körben alkalmazzák őket a takarmányiparban és más területeken:
- Kórokozó adszorpció: Az élesztő Mannan kötődik a káros kórokozókhoz, mint például a Salmonella és az E. coli a bélben, megakadályozva őket, hogy betartozzon a bél bélését, és elősegíti a testből való eltávolításukat. A mannooligoszacharidok és a kórokozó-kötő receptorok szerkezete hasonló, amelyek versenyképes módon kötődhetnek a kórokozóhoz és megakadályozzák a kórokozó adhéziót.
- Mikotoxin-kötés: Az élesztőcellák falai hatékonyan felszívják a mikotoxinokat, főleg Zearalenon és Deoxynivalenol (DON), általában a penészes takarmányban található.
- Immunrendszer lendülete: A β-Glukánok aktiválják az immunrendszert az immunsejtreceptorokhoz való kötéssel, és mind a veleszületett, mind az adaptív immunválaszokat kiváltják.
- Stresszcsökkentés: Az élesztőcellás fali termékek hozzáadása a szarvasmarha-táplálékhoz segít csökkenteni a stresszt az átmenetek során, például a csoportváltozások és az előadások beállításai.
- Csökkent hőfeszültség: A sertések, különösen a fiatalok, hajlamosak a hőstresszre, mivel korlátozott verejtékmirigyeik vannak. Az élesztősejtfal termékek segíthetnek ezen a problémán.
Alkalmazási Területek és Eredmények
A találmány szerinti enzimkészítmény előnyösen β-glukán tartalmú anyagokat, így mikróbasejt falakat módosító vagy lebontó szerként alkalmazható. Magától értetődő, hogy az enzimkészítményt minden egyes felrepeszteni vagy elbontani kívánt sejtfal esetében specifikusan kell alkalmazni. A mikroba sejtfalak felrepesztését követően kinyert extraktum rendszerint számos különböző összetevőt tartalmaz, mint a vitaminok, színezékek, íz- és aromaanyagok, emulgeálószerek és stabilizáló szerek.
Az élesztő extraktumok ezen felül tartalmazhatnak karotinoidokat (például β-karotin és astaxanthint), enzimeket, proteineket és aromaanyagokat vagy ízfokozó szereket (pl.: MSG, 5'-GMP és 5'-IMP). Továbbá a találmány szerinti endo-1,3(4)-β-glukánáz enzim felhasználható az élesztő sejtek falának, például a Saccharomyces cerevisiae sejtfalának külső mannan proteinje kinyerésében is. Ezen túlmenően a találmány szerinti enzimkészítmény felhasználható élesztőkből (pl.: Saccharomyces sp. vagy Schizosaccharomyces sp.) vagy gombákból (pl.: Aspergillus sp. vagy Penicillium sp.) történő protoplaszt előállításra. Ezekből a mikroorganizmusokból származó protoplasztok előállítása és regenerálása fontos fúziós, transzformációs és klónozási vizsgálatokban.
Konkrét példák az élesztősejtfal termékek alkalmazására és hatékonyságára:
- Brojlercsirkék teljesítménye: Egy kísérletben Cobbe brojlereket tápláltak 0.5, 1 és 2 kg/t élesztőfallal (YEAMOS, az Angel Yeast Co. Ltd. terméke). Összesen 93000 egynapos COBB brojlereket választottak ki, és véletlenszerűen 2 csoportra osztottak. A kísérleti csoportot 1 kg/t élesztőssejt falával (YEAMOS) egészítették ki 38 napig. A brojlerek teljesítménye a kísérleti csoportban jobb volt, mint a kontrollcsoportban. Az átlagos vágóhíd súlya körülbelül 0.6%-kal nőtt.
- Tojótyúkok tojástermelése: A 30-32 hetes Hy-Line barna kereskedelmi tyúkok átlagos tojássúlya 4,01%-kal és 3,44%-kal növelte, ha az étrendben az Angel Yeast Co. Ltd. élesztősejtfal termékét alkalmazták. Összesen 71000 rétegű tyúkot kb. 27-29 hetes tyúk két csoportra osztottak. A kísérleti csoportot 24 napig kiegészítették 1 kg/t élesztőssejt falával (YEAMOS).
Kereskedelmi hozzáférhetőség
Élesztősejtfal por beszerezhető szakosodott forgalmazóktól. Például a HJHERB iparágvezető gyártója és forgalmazója kiegészítők számára. A HJAGREDED.com kizárólag több mint 500 természetes alapanyag biztosítására szolgál különféle állati iparágak számára, például takarmányok, baromfi, sertés, kérődzők, akvakultúra-fajok és mezőgazdasági műtrágya számára. A cég ingyenes mintákat is kínál kutatás-fejlesztési vizsgálatokhoz, biztosítva a termék minőségét és tisztaságát. Az élesztősejtfal eladó csomagolása döntő szerepet játszik a termék frissességének, minőségének és eltarthatóságának megőrzésében, ezért többrétegű kraft papírzacskóba, élelmiszer-minőségű PE belső táskával csomagolják, nettó 25 kg/táska kiszerelésben.